Крашенюк А.И. Разработка и производство нового поколения вирионных гриппозных вакцин

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук: специальности 03.00.06 — вирусология и 03.00.04 — биохимия / Российская академия медицинских наук. НИИ гриппа. — Санкт-Петербург, 1995. — 84 с.Целью работы в обосновании и разработке универсальной фильтрационно-хроматографической технологии получения вирионных гриппозных вакцин.Задачи: 1) Разработке методов предварительной очистки и концентрированию вирусных суспензий; 2) Разработке хроматографических методов очистки вирионов; 3) Обоснованию и разработке универсальной фильтрационно-хроматографической технологии получения вирионных вакцин; 4) Разработке методов контроля технологического процесса очистки вирусных суспензий; 5) Разработке препаративного метода выделения гемагглютинина вируса гриппа; 6) Разработке технологии получения очищенной живой гриппозной вакцины (ОЖГВ) для интраназального применения.Научная новизна. При выполнении работы основное внимание уделялось экспериментальным исследованиям процессов выделения, очистки и анализа вирусов и вирусных белков мембранными, хроматографическими и электрофоретическими методами. 1) Впервые предложены новые безасбестовые фильтровальные материалы для осветления вируссодержащих суспензий — стекловолоконные и базальтоволоконные фильтры, обладающие высокими технологическими качествами. 2) Впервые установлено, что повышение гемагглютинирующей и инфекционной активности ингибиторочувствительных вирусов при различных способах очистки связано с удалением неспецифических ингибиторов гемагглютинации. Разработаны методики микро- и диафильтрации для концентрирования и очистки различных вирусов на мембранах различного типа и полых волокнах. 3) Впервые проведена оптимизация процесса очистки вирусов методом ЭЖХ на основе математической теории эксперимента, предложены для практики новые сорбенты на основе модифицированных макропористых кремнеземов (МПК), превосходящих промышленный образец. 4) Впервые исследованы сравнительные возможности различных хроматографических методов очистки вирусов ЭЖХ на МПК, биоспецифической, распределительной жидкостной хроматографии. 5) Впервые на основе комплексных исследований разработана универсальная фильтрационно-хроматографическая технология получения ИГВ. Новая технология позволяет получить препарат со стабильными технико-экономическими показателями, независимо от используемых штаммов вируса гриппа, применима для очистки и других вирусов. Разработаны вопросы аппаратурного оформления фильтрационно-хроматографической технологии получения ИГВ. 6) Впервые разработана методика потенциометрического иммунофильтрационного анализа вирусных антигенов. 7) Впервые разработаны методы аналитического и препаративного выделения вируса гриппа основных серотипов с помощью ИЭФ в борат-полиольных системах. 8) Впервые в условиях микрогравитации показана возможность выделения гидрофобных вирусных белков методами электрофореза, пригодных для получения антисывороток (на примере НА вируса гриппа). 9) Впервые введено теоретическое положение о новой физико-химической характеристике вирионов — гидрофобности вирусной частицы и показано различие по этой характеристике для различных штаммов вируса гриппа. 10) Впервые установлена зависимость между гидрофобностью вирусных частиц и на иммуногенностностью. 11) Впервые высказано предположение о наличия гидрофобных зон вблизи рецепторной щели молекулы НА вируса гриппа. 12) Впервые на основе комплексного исследования вопросов очистки и выделения вирусов с учетом их биологических свойств и характера иммунного ответа на вакцинацию создана концепция "щадящей технологии" получения противогриппозных вакцин. 13) Впервые разработана технология получения очищенной живой гриппозной вакцины для взрослых.Практическая значимость и теоретическая ценность работы. Внедрение результатов исследований в промышленности, научно-исследовательской и учебной работе. 1) Разработаны методические требования к фильтрам для очистки вируссодержащих жидкостей от надмолекулярных образований (эритроцитов, фрагментов клеток и клеточных мембран и др.). Экспериментально исследованы свойства фильтрозальных материалов различной композиции на основе стекло- и базальтоволокна для очистки вирусных суспензий. С 1984 г. Косинская бумажная фабрика начала промышленный выпуск картонов для осветления биологических жидкостей и биотехнологическом производстве; 2) Методика предочистки вирусных суспензий на стекловолоконных фильтрах внедрена на предприятии НИИЭМ им. Пастера при получении ИГВ по фильтрационно-седиментационной технологии (регламент № 130-79, ведомость изменений 3, утверждена ГУ ПБВП 24.02.84 г.), за 1984-1985 гг. выпущено 45 млн. доз ИГВ; в Томском НИИВС при производстве инактивированной вакцины против клещевого энцефалита (изменение № 1 к регламенту производства вакцины клещевого энцефалита культуральной инактивированной № 235-81. утв. 6.12.1985 г.); 3) разработана и внедрена в практику фильтрационно-хроматографическая технология получения ИГВ для взрослых (регламент № 210-81). С 1982 г. на предприятии НИИЭМ им. Пастера выпущено 9197 тыс. доз вакцины, экономический эффект от выпуска вакцины за 5 лет (1983-1987 гг.) составил 490, 3 тыс. руб.; 4) Разработана и внедрена технология получения высокоочищенной гриппозной вакцины для детей иммуносорбционным методом (лабораторный регламент получения вакцины гриппозной хроматографической очищенной жидкости инактивированной для детей № 169, утв. 10.06.1981 г.). С 1985 г. на предприятии НИИЭМ им. Пастера выпущено 3707,5 тыс. доз. вакцины, экономический эффект от её выпуска составил за три года (1985-1987) 843,0 тыс. руб.; 5) На основе МТЭ выполнена и экспериментально подтверждена оптимизация очистки вирусной суспензии методом ЭЖХ, что создаёт предпосылки увеличить выход целевого продукта-вируса в промышленных условиях и повысить степень его очистки; 6) Усовершенствованные методики позволяют оптимизировать процесс мембранного разделения хроматографической очистки вирусов, повысить степень очистки целевого продукта; 7) Разработан принципиально новый ультрафильтрационный метод иммунного потенциометрического анализа, позволяющий осуществить индикацию вирусных антигенов на уровне чувствительности иммуноферментного анализа; 8) На основе разработанной фильтрационно-хроматографической технологии получения очищенных вирусных суспензий сформулированы требования и разработано техническое задание на изготовление фильтрационно-хроматографической линии ФХЛ-1. В НТО АН СССР изготовлены две линии ФХЛ; 9) Разработанный метод выделения гемагглютинина на основе изоэлектрофокусирования (ИЭФ) был использован для получения гемагглютининов Н1, Н3 на установке "Таврия" в условиях микрогравитации; 10) Проведены исследования санитарно-гигиенических свойств фильтрованных и сорбционных материалов, позволившие получить сертификат на использование полисульфонамидных мембран, стекловолоконных фильтров и микропористого стекла, модифицированного стиролом. для получения вирусных вакцин и препаратов крови; 11) Материалы о взаимосвязи между гидрофобностью иммуногенностью вирусов использованы на кафедре микробиологии Крымского медицинского института, начиная с 1985 г. в лекциях и практических занятиях по курсу вирусологии для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов; 12) На основе предложенной концепции "щадящей технологии" получения гриппозных вакцин разработана технология получения очищенной живой гриппозной вакцины (ОЖГВ) для интраназального применения. Разработаны ЭПР и ВФС на "Вакцину очищенную живую аллантоисную сухую для интраназального применения".